Базовая конфигурация современного прямого микроскопа показана на рисунке 1 (микроскоп Nikon серии Eclipse E600). Поляризатор и четвертьволновая пластинка смонтированы в общем корпусе, который крепится установочным винтом в основной световой порт микроскопа. После установки в заданное положение, отклоняющая пластинка остается в предварительно выставленном положении, тогда как поляризатор можно поворачивать на 90 градусов (+ 45 градусов) вокруг оптической оси микроскопа. В зависимости от ориентации поляризатора относительно отклоняющей пластинки, компенсатор Сенармона освещает оптическую систему микроскопа светом с линейной, эллиптической или круговой поляризацией.
Рис. 1. Конфигурация ДИК-микроскопа с компенсатором Сенармона
Для подробного ознакомления с медицинской и исследовательской техникой основных мировых производителей оптических систем и сопутствующего оборудования посетите наш каталог или свяжитесь с нашими специалистами и получите полную профессиональную консультацию по любым, имеющимся у Вас, вопросам.
Поляризованный волновой фронт, выходящий из компенсатора Сенармона, сначала попадает на неподвижную призму Номарского, установленную в блоке конденсора (см. рисунок 1), после чего перенаправляется и расщепляется на ортогональные составляющие (обыкновенный и необыкновенный волновые фронты), колебания в которых направлены под углом 45 градусов к поляризованному свету, выходящему их компенсатора Сенармона. Система линз конденсора фокусирует расщепленные волновые фронты в параллельные лучи и проецирует их на образец. Вышедший из образца свет собирается объективом и фокусируется в интерференционной плоскости второй призмы Номарского, которая расположена в револьверном держателе микроскопа. Расположенная в держателе объектива и согласованная с призмой конденсора вторая призма Номарского соединяет расщепленные лучи в коаксиальные ортогональные составляющие. Хотя линейно-поляризованный свет, выходящий из второй призмы Номарского, блокируется анализатором, эллиптически и циркулярно-поляризованный свет способен проходить сквозь компоненты оптической системы и формировать изображение образца.
Впервые метод дифференциально-интерференционной микроскопии был разработан и предложен Френсисом Смитом (Francis Smith) в 1955 году. Смит сконструировал модифицированный поляризационный микроскоп, установив в передней фокальной плоскости конденсора и в задней фокальной плоскости объектива призмы Волластона. Из-за конструктивных ограничений призмы Волластона были впоследствии заменены усовершенствованной системой, предложенной французским ученым Жоржем Номарским (Georges Nomarski). В системе Номарского призмы физически находятся на некотором расстоянии от сопряженных апертурных плоскостей конденсора и объектива. Такая модификация позволила использовать оптические компоненты стандартных микроскопов в современных ДИК-системах, которые в настоящее время находят самое широкое применение.
Аналогично методу фазового контраста, ДИК-микроскопия удобна для визуализации живых клеток и других прозрачных неокрашенных образцов, которые трудно поддаются наблюдению в традиционном светлопольном освещении даже при использовании полной апертуры и максимального разрешения оптической системы микроскопа. При этом ДИК-микроскопия не подвержена таким артефактам, как эффект гало и маскированию апертур, присущих фазово-контрастной оптике, и позволяет получать изображения превосходного качества сравнительно толстых образцов. Кроме того, контраст ДИК-изображений легко повышается при помощи цифровой видеотехники.
Рис. 2. Происхождение контраста в ДИК-микроскопии
Эффект дифференциально-интерференционного контраста состоит в преобразовании разности оптических путей в образце в разность амплитуд (интенсивностей, как показано на рисунке 2), которую можно наблюдать в виде изображения повышенной контрастности в окулярах микроскопа (либо регистрировать на пленке или цифровым способом). Главными определяющими факторами длины оптического пути в образце является разность показателей преломления образца и окружающей среды, а также геометрическое расстояние, которое проходят расщепленные волновые фронты между двумя точками оптического пути. Изображения, полученные при помощи ДИК-системы, имеют «оттененный» вид и выглядят псевдо-трехмерными, как если бы они были получены при освещении светом одного направления, сильно отличающегося от перпендикулярного. В общем случае, метод ДИК удобен для определения ориентации фазовых градиентов и использования полной апертуры объектива, с целью получения тонких оптических срезов образца, свободных от затемнений, создаваемых элементами, расположенными за промежуточной фокальной плоскостью.
Призмы Волластона и Номарского
Основными элементами дифференциально-интерференционной микроскопии являются согласованные двоякопреломляющие призмы Волластона и/или Номарского. Эти призмы устанавливаются в оптический путь микроскопа так, что их оси расщепления ориентированы под углом 45 градусов (с северо-запада на юго-восток) к поляризатору или анализатору. Призма Волластона состоит из двух прецизионно-отшлифованных и отполированных клиновидных кварцевых пластинок с перпендикулярно ориентированными оптическими осями, склеенных по гипотенузам и образующих оптически-анизотропную составную пластинку. Входящие в призму Волластона фронты падающих линейно-поляризованных волн (ориентированных под углом 45 градусов оптическим осям призмы) разделяются на две ортогональные волны, называемые обыкновенной и необыкновенной.
Поскольку падающие фронты исходят из локализованных участков одного источника (обычно, вольфрамовой нити накаливания галогенной лампы), ортогональные волны, формируемые призмой Волластона, когерентны, имеют одинаковую амплитуду и распространяются в одном направлении через нижнюю клиновидную призму (см. рисунок 3(a)). Обыкновенная волна проходит через призму в направлении, перпендикулярном оптической оси, тогда как необыкновенная волна ориентирована параллельно этой оси. Кроме того, различие в диэлектрических параметрах вдоль этих перпендикулярных осей приводит к тому, что одна из волн проходит через призму с более высокой скоростью, нежели другая. Обыкновенная волна проходит через призму вдоль «быстрой» оси (с меньшим показателем преломления), а необыкновенная — вдоль «медленной» оси (с более высоким показателем преломления).
Рис. 3. Призмы Волластона и Номарского для ДИК-микроскопии
При изменении показателя преломления (в месте склейки кварцевых клиньев) происходит угловое расщепление или сдвиг волновых фронтов, в результате которого волны пространственно разделяются на угол, называемый углом сдвига. Кроме того, на границе клиновидной призмы волновые фронты изменяются — обыкновенная волна становится необыкновенной, и наоборот. В призме угол сдвига и величина пространственного расщепления одинаковы для всех падающих волновых фронтов, независимо от точки входа, а направление сдвига волнового фронта определяется осью сдвига призмы. Эта ось лежит в продольной плоскости призмы Волластона и параллельна направлению оптической оси нижнего кварцевого клина. В общем случае, призма Волластона (или Номарского) создает сдвиг величиной менее одного микрометра, вследствие чего выходящий из призмы пучок света не имеет видимого расщепления.
В результате разности показателей преломления обыкновенного и необыкновенного волновых фронтов, скорости прохождения этими фронтами верхней и нижней частей призмы Волластона также различны. В том случае, когда геометрические пути через верхнюю и нижнюю половины призмы одинаковы, фазовый сдвиг, испытываемый волновыми фронтами в нижней части призмы, в точности компенсируется в ее верхней половине. Однако, волновые фронты, падающие на призму на расстоянии от ее центра, проходят более длинную часть пути либо через верхнюю, либо через нижнюю половину призмы, в результате чего испытывают постоянный фазовый сдвиг на единицу длины в направлении оси сдвига. Фазовый сдвиг для обыкновенного и необыкновенного волновых фронтов одинаков по величине, но противоположен по направлению. В результате, на одном конце призмы необыкновенный волновой фронт выходит впереди обыкновенного, а в соответствующей точке на другом конце призмы обыкновенный волновой фронт выходит перед необыкновенным. Фокальная, или интерференционная плоскость призмы Волластона проходит по центру призмы, где оптические пути через верхний и нижний кварцевые клинья равны. По этой причине, зачастую трудно (или даже невозможно) использовать призму Волластона со стандартными объективами микроскопов, задняя фокальная плоскость которых (она должна физически совпадать с интерференционной плоскостью призмы Волластона) оказывается расположенной глубоко внутри линзы.
Подобно традиционной призме Волластона, базовая конструкция призмы Номарского (рисунок 3(b)) также состоит из двух кварцевых клиньев, склеенных по гипотенузам. Верхний клин идентичен верхнему клину призмы Волластона, однако нижний клин призмы Номарского вырезан из кварцевого кристалла таким образом, что его оптическая ось направлена под непрямым углом к плоской грани призмы. Когда клинья соединяются в двоякопреломляющую призму, ее фокальная (интерференционная) плоскость оказывается в нескольких миллиметрах вне пластинки призмы. Этот эффект обусловлен сдвигом, который имеет место на границе раздела «кварц-воздух» в нижнем клине призмы, в отличие от склеенной границы, как в призме Волластона. В результате преломления на границе раздела кварцевых клиньев призмы Номарского, расщепленные волновые фронты сходятся в точке пересечения, находящейся вне призмы (рисунок 3(b)). Действительное положение фокальной плоскости призмы Номарского можно регулировать в диапазоне нескольких миллиметров, путем изменения угла наклона оптической оси в нижнем кварцевом клине призмы.
Во избежание проблемы апертурного зазора объектива, в современные ДИК-микроскопы устанавливаются, как правило, призмы Номарского. В действительности, для расщепления и объединения обоих пучков в фокальных плоскостях конденсора и объектива часто используются модифицированные призмы. Несмотря на некоторые пространственные ограничения для призм конденсора, которые часто могут быть точно расположены в апертурной плоскости, в большинстве случаев, по-прежнему используется призма Номарского. Призмы Номарского для конденсоров могут иметь специальную конструкцию, с тем, чтобы формировать интерференционную плоскость гораздо ближе к призме, чем это имеет место у призм, использующихся с объективами. В результате, помимо того, что две призмы Номарского в современном микроскопе устанавливаются в оправы разной конфигурации и размеров, они, зачастую, по-разному вырезаны и, соответственно, не взаимозаменяемы.
Дифференциально-интерференционная оптическая система с компенсатором Сенармона
Традиционная оптическая система дифференциально-интерференционного микроскопа содержит поляризатор, расположенный перед конденсором и анализатор (еще один поляризатор), который устанавливается в оптический путь над объективом, обычно, в промежуточном тубусе, либо в одной оправе с призмой Номарского. Ось плоскости распространения колебаний в поляризаторе располагается в направлении запад-восток, а в анализаторе она перпендикулярна этому направлению (располагается в направлении север-юг). Призма Номарского, установленная в конденсоре, вблизи сопряженной фокальной плоскости апертуры ирисовой диафрагмы, расщепляет выходящий из поляризатора линейно-поляризованный свет на две составляющие. Падающие волновые фронты расщепляются призмой на ортогональные поляризованные составляющие, которые собираются оптической системой конденсора в параллельный пучок, использующийся для освещения образца.
После того, как расщепленные волновые фронты собираются и фокусируются объективом, они объединяются в сопряженной плоскости задней апертуры при помощи второй призмы Номарского (которая, обычно, устанавливается в регулируемой подвижной оправе). Составляющие объединенных волновых фронтов с круговой и эллиптической поляризацией проходят через анализатор и, затем, интерферируют, создавая ДИК-изображение в промежуточной плоскости изображения микроскопа.
Рис. 4. Влияние компенсатора Сенармона на волновые фронты
В идеально отъюстированном ДИК-микроскопе изображение призмы конденсора отображается конденсором и объективом на призму объектива таким образом, что сдвиг волнового фронта совпадает в каждой точке поверхности призм, инвертированных друг другу. Перемещение любой из призм вдоль оси сдвига, (перпендикулярной к оптической оси микроскопа), приводит к несовпадению волнового фронта, равномерному по всей апертуре микроскопа. Смещение фазового сдвига обыкновенного волнового фронта относительно необыкновенного, вызываемое перемещением призмы, часто называют введением волнового сдвига в ДИК-микроскопии. По мере бокового смещения одной из призм Номарского (обычно, призмы объектива), происходит фазовый сдвиг пары волновых фронтов, участвующих в формировании фона, и их смещение по фазе относительно друг друга. Таким образом, ориентацию вектора поляризации света, выходящего из расположенной у объектива призмы Номарского, можно изменять от линейной (смещение призмы отсутствует), до различных степеней эллиптической, и даже до круговой.
Введение в оптическую ДИК-систему волнового сдвига вызывает изменение интенсивности (амплитуды) фазовых градиентов в образце, в результате чего формируются ориентационно-зависимые светлые и темные участки, которые накладываются на более светлый фон. Градиенты интенсивности возникают вдоль оси сдвига призм конденсора и объектива и, при наблюдении образца через окуляры микроскопа, выглядят, обычно, проходящими под углом 45 градусов (с северо-запада на юго-восток, и наоборот). Смещение призмы в одном или в другом направлении поперек оптической оси микроскопа изменяет соотношение фаз ортогональных волновых фронтов, изменяя ориентацию затененных областей образца на обратную. Конечным результатом является псевдо-трехмерное рельефное изображение образца, на котором области, соответствующие более длинному оптическому пути (наклонному градиенту оптических пучков) выглядят более светлыми или темными, а участки, соответствующие более короткому оптическому пути, выглядят имеющими обратные (противоположные) уровни освещенности.
Растущей популярностью пользуется альтернативный метод введения волнового или фазового сдвига, состоящий в установке (в фиксированной ориентации) между поляризатором и призмой конденсора четвертьволновой фазовой пластинки (компенсатора Сенармона для ДИК-метода). При максимальном ослаблении (используются несмещенные согласованные призмы; см. рисунок 4(b)), «быстрая» ось фазовой пластинки совпадает с осью распространения колебаний в поляризаторе, а оба оптических элемента могут устанавливаться (и часто устанавливаются) в общий корпус в основании микроскопа. В микроскопах, оснащенных соответствующим промежуточным тубусом (см. рисунок 1), компенсатор Сенармона может устанавливаться в альтернативном положении — между призмой объектива и анализатором.
Для введения фазового сдвига при помощи компенсатора Сенармона ось распространения колебаний в поляризаторе поворачивается (до плюс или минус 45 градусов; см. рисунки 4(a) и 4(с)) относительно «быстрой» оси пластинки фазового сдвига, которая остается зафиксированной под углом 90 градусов относительно оси распространения колебаний в поляризаторе. Когда «быстрая» ось компенсатора совпадает (параллельна) с осью распространения колебаний в поляризаторе, через компенсатор Сенармона в призму конденсора проходит только линейно-поляризованный свет (см. рисунок 4(b)). Однако, когда ось распространения колебаний в поляризаторе поворачивается, выходящие из четвертьволновой фазовой пластинки волновые фронты становятся эллиптически- поляризованными. Поворот поляризатора в одном направлении создает пучок света с правосторонней эллиптической поляризацией (рисунок 4(a)), тогда как поворот в противоположном направлении изменяет траекторию вектора поляризации и создает левостороннее эллиптическое вращение (см. рисунок 4(с)).
Рис. 5. Фазовый сдвиг в ДИК-микроскопии с компенсатором Сенармона
Когда ось распространения колебаний в поляризаторе поворачивается на 45 градусов (эквивалент четвертьволнового фазового сдвига), проходящий через компенсатор свет получает круговую поляризацию (с левосторонним или правосторонним поворотом вектора поляризации). Поскольку эллиптическая или круговая поляризация света представляет собой разность фаз между обыкновенным и необыкновенным волновыми фронтами, выходящими из компенсатора Сенармона, сдвиг в системе возникает тогда, когда волновые фронты входят в конденсорную светоделительную призму Номарского и разделяются (см. рисунок 5). Поворот поляризатора в одну сторону создает положительный сдвиг, а в противоположную сторону — отрицательный. Количественно сдвиг, вносимый компенсатором Сенармона, определяется по следующей формуле:
фазовый сдвиг (в нанометрах) = θλ/180,
где θ — угол поворота (в градусах) оси распространения колебаний в поляризаторе относительно «быстрой» оси в фазовой пластине; λ — средняя длина волны света, проходящего через компенсатор. Для вычисления вносимого сдвигового замедления в случае освещения вольфрамово-галогенной лампой, среднюю длину волны часто принимают равной 550 нм. При использовании компенсаторов Сенармона фазовый сдвиг в диапазоне от одной двадцатой до полной длины волны можно легко измерить с точностью 0,15 нанометра.
На рисунке 5 показан эффект фазового сдвига, вносимого в оптическую ДИК-систему компенсатором Сенармона, находящимся в трех различных ориентациях. На всех схемах рисунка 5 представлен одиночный волновой фронт, входящий в центральную часть призмы Волластона, однако, в этом случае призма Номарского работает аналогично. Когда ось распространения колебаний в поляризаторе параллельна «быстрой» оси четвертьволновой фазовой пластинки (рисунки 4(b) и 5(b)), линейно-поляризованный свет выходит из компенсатора и падает на грань нижнего клина конденсорной призмы Волластона (как показано на рисунке 5(b)). В микроскопе, работающем по принципу дифференциально-интерференционного контраста, падающий линейно-поляризованный свет ориентирован под углом 45 градусов к «быстрой» и «медленной» осям нижнего клина призмы Волластона (или Номарского). После входа в призму, поляризованный свет разделяется на ортогональные составляющие, которые проходят по «быстрой» и «медленной» оптическим осям нижнего кварцевого клина, и сдвигаются по фазе относительно друг друга на границе между двумя клиньями призмы. Поскольку линейно-поляризованный фронт при входе в призму представляет собой одну фазу, ортогональные компоненты, образующиеся на границе «воздух-кварц», изначально синфазны, однако внутри призмы они подвергаются фазовому сдвигу.
Как уже упоминалось выше, фазовое приращение обыкновенного волнового фронта в нижней части призмы Волластона становится смещением в верхнем клине призмы, после того, как волновые фронты изменяют ориентацию. В результате происходит ликвидация (компенсация) фазового сдвига, образовавшегося внутри призмы, и ортогональные волновые фронты выходят из призмы Волластона синфазными (рисунок 5(b)). При этом условии оптическая система создает максимальное ослабление, в результате чего видны только большие фазовые градиенты, присутствующие в образце. Эти фазовые градиенты накладываются на очень темный, или черный фон, и приобретают вид темнопольного изображения.
Ситуация полностью изменяется, когда поляризатор в компенсаторе Сенармона поворачивается в одном из направлений относительного нулевого положения. Выходящие из компенсатора волновые фронты имеют фазовый сдвиг, который придает векторной сумме ортогональных волновых составляющих эллиптический или круговой характер. При повороте поляризатора на 30 градусов влево (отрицательный фазовый сдвиг; рисунок 5(a)), создаваемый компенсатором Сенармона обыкновенный волновой фронт входит в призму Волластона раньше необыкновенного волнового фронта, а выходит из призмы (после того, как волновые фронты меняют ориентацию), как необыкновенный волновой фронт, впереди обыкновенного. Основной результат состоит в формировании разности оптических путей, необходимой для внесения фазового сдвига. При повороте поляризатора Сенармона вправо (положительный фазовый сдвиг) возникает противоположный эффект, и обыкновенный волновой фронт выходит из призмы Волластона впереди необыкновенного (рисунок 5(с)).
Конечный результат введения волнового сдвига в дифференциально-интерференционную систему не зависит от способа достижения этого сдвига — перемещения призмы Номарского или поворота поляризатора в компенсаторе Сенармона. В микроскопе соответствующей конфигурации, правильно отъюстированном для освещения по Кёлеру, изображение источника света и конденсорной призмы проецируется оптической системой (конденсором и объективом) на вторую (обратную) призму Номарского, расположенную в задней фокальной плоскости объектива. Линейный сдвиг фазы на всей поверхности призмы конденсора, полностью компенсируется противоположным сдвигом фазы в призме объектива. Перемещение призмы объектива вдоль оси сдвига не влияет на распределение фазового сдвига, но вносит постоянный, положительный или отрицательный, фазовый сдвиг по всей апертуре микроскопа. Аналогично, поворот поляризатора в компенсаторе Сенармона также вносит изменяемый и контролируемый фазовый сдвиг. Система согласованных призм позволяет формировать изображение с одним и тем же волновым сдвигом для каждого из оптических пучков, проецируемых из апертуры конденсора, независимо от пути, по которому тот или иной пучок прошел через образец и достиг объектива.
Рис. 6. Фазовый сдвиг, создаваемый компенсатором Сенармона
На рисунке 6 представлена серия цифровых изображений, полученных по методу дифференциального интерференционного контраста, в диапазоне волнового сдвига от одной двадцатой до четверти волны, с несколькими промежуточными значениями. В качестве образца толщиной 5 микрометров использованы эпителиальные клетки слизистой оболочки щеки человека, помещенные на предметное стекло микроскопа в буферном физиологическом растворе. Изображение получено через покровное стекло толщиной 170 мкм. Клетки образца характеризуются участками с изменяющейся толщиной в диапазоне от 1 до 4 микрометров. Детали образца и теневые псевдо-трехмерные эффекты наиболее отчетливо проявляются при нижних значениях волнового сдвига (рисунки 6(a) и 6(b)); при увеличении сдвига контраст и разрешение тонких деталей образца ухудшаются (рисунки 6(с) — 6(f)). При максимальном сдвиге(четверть волны; рисунок 6(f)) контраст изображения чрезвычайно низка, структурные детали практически не видны. Для рассматриваемого образца оптимальный сдвиг лежит в диапазоне от одной двадцатой до одной двенадцатой длины волны.
В микроскопии по методу ДИК, контрастность изображения возрастает с увеличением градиента (разности) оптических путей. Кроме того, из рисунка 6 видно, что варьирование сдвигового замедления может приводить к значительным флуктуациям контрастности изображения образца в окулярах микроскопа. В общем случае, оптимальное отклонение между обыкновенным и необыкновенным волновыми фронтами, создаваемое перемещением призмы объектива или поворотом поляризатора в компенсаторе Сенармона, меньше одной десятой длины волны. Однако, это значение сильно зависит от толщины образца, — для биологических образцов полезный диапазон значений волнового сдвига составляет от одной тридцатой до четверти длины волны. Хороший контраст изображений образцов с очень большими значениями оптического градиента получается даже при больших значениях волнового сдвига (вплоть до целой длины волны). Введение фазового сдвига в ДИК-микроскопию существенно облегчает наблюдение фазовых образцов и до невероятной степени упрощает получение снимков пленочными или цифровыми камерами.
