С целью получения дополнительной количественной информации о разности оптических путей (см. рисунок 7) и создания интерференционной картины Ньютоновских цветовых полос, в микроскопы, оснащенные компенсатором Сенармона для ведения фазового сдвига в дифференциально-контрастную оптическую систему, можно устанавливать компенсирующие пластинки целой длины волны. В оптическую систему ДИК-микроскопа с компенсатором Сенармона волновые пластинки могут устанавливаться между призмой объектива и анализатором, либо между компенсатором и призмой конденсора. Для этой цели в промежуточном тубусе или в блоке конденсора многих микроскопов предусмотрено щелевое гнездо. Установка компенсатора первого порядка (часто называемого полноволновой или красной волновой пластиной первого порядка) со значением сдвига, равным длине волны зеленого диапазона видимого света (приблизительно, 550 нанометров), вносит в образец и в фон интерференционный цветовой спектр (рисунок 7). При установленном компенсаторе зеленый свет не может пройти через анализатор, поскольку он выходит из волновой пластинки линейно-поляризованным, и вектор его электрического поля имеет ту же ориентацию, что и поляризатор. Однако, волновые фронты красной и синей областей спектра испытывают фазовый сдвиг, меньший, чем длина волны, и становятся эллиптически- поляризованными, что позволяет проходить через анализатор. В результате, эти цвета смешиваются и создают в поле зрения пурпурный фон.
Для подробного ознакомления с медицинской и исследовательской техникой основных мировых производителей оптических систем и сопутствующего оборудования посетите наш каталог или свяжитесь с нашими специалистами и получите полную профессиональную консультацию по любым, имеющимся у Вас, вопросам.
Рис. 7. Оптическое окрашивание в ДИК-микроскопии с компенсатором Сенармона и полноволновой пластиной
При наблюдении образца в белом свете (от вольфрамово-галогенной лампы) через дифференциально-интерференционную оптическую систему с компенсатором Сенармона в виде волновой пластинки первого порядка, фон окрашивается в пурпурный цвет, а контраст изображения формируется синим цветом второго порядка и желтым цветом первого порядка (в зависимости от ориентации) Ньютоновских интерференционных полос. При наблюдении через оптическую систему с фазовой пластиной структур с большими градиентами, небольшие изменения сдвигового замедления (в результате поворота поляризатора в компенсаторе Сенармона) приводят к быстрым изменениям интерференционных цветов. Этот метод полезен для внесения цвета (оптическое окрашивание) в области образца, обладающие большим граничным коэффициентом преломления, например, клеточные мембраны, крупные внутриклеточные частицы, жгутики и ядра. Разность оптических путей можно оценить, сравнив интерференционные цвета, создаваемые элементами образца, со значениями цветовой шкалы Майкла-Леви.
На рисунке 7 представлены псевдотрехмерные изображения нескольких полупрозрачных образцов, полученные по стандартной методике сдвигового замедления и методом оптического окрашивания, с четкой демонстрацией различных цветов спектра. Рисунок 7(a) иллюстрирует бороздки на ктеноидной рыбьей чешуе при сдвиговом замедлении, равном, приблизительно, одной двенадцатой длины волны. Установка в оптическую систему микроскопа пластинки-компенсатора первого порядка дает изображение, приведенное на рисунке 7(b). Здесь ктеноидная чешуя имеет интерференционную окраску синим цветом второго порядка и желтым цветом первого порядка, на пурпурном фоне. Аналогичным образом, изображение гидроидного полипа Obelia выявляет большое количество структурных деталей при малых и промежуточных значениях сдвигового замедления (рисунок 7(с)), а с фазовой пластиной в оптической системе дает богатый цветовой спектр (рисунок 7(d)). Кроме того, оптическое окрашивание может оказаться полезным для получения обращенной окраски теневых эффектов, что иллюстрируется изображением прозрачного толстого среза почечной ткани мыши (см. рисунки 7(e) и 7(f)). Хотя представленные на рисунке 7 изображения и не выявляют скрытой научной информации в отношении представленных образцов, они дают возможность методу дифференциально-контрастной оптической микроскопии стать узаконенным мостиком между наукой и искусством.
Интерпретация изображений, полученных по методу ДИК с использованием компенсатора Сенармона
При наблюдении ориентации и распределения теней, имеющихся практически на всех изображениях, полученных с использованием компенсатора Сенармона, направление оптического сдвига становится очевидным, и может быть точно определено, как ось, соединяющая области с наибольшими и наименьшими значениями интенсивности. Уровень контрастности, создаваемый фазовыми градиентами образца, (и степень псевдотрехмерности) за счет дифференциально-интерференционного контраста по Сенармону, является функцией величины сдвига, вносимого в оптическую систему поворотом поляризатора в компенсаторе. Поскольку ось сдвига неподвижна (вследствие конструкции призмы Номарского и других ограничений, связанных с ориентацией волнового фронта в ДИК-микроскопии), воздействие на контраст образца путем простой настройки микроскопа (изменения направления оси) невозможно. Однако, повернув поляризатор в компенсаторе Сенармона на соответствующий отрицательный угол, относительное запаздывание по фазе между обыкновенным и необыкновенным волновыми фронтами можно изменить на противоположное. В случае такого изменения фазового запаздывания ориентация границ светлых и темных участков на изображении образца изменяется на 180 градусов. В сущности, микроскописту доступен единственный способ изменения ориентации оси сдвига относительно образца, — изменение ориентации самого образца. Этот маневр обеспечивается за счет использования круглых предметных столиков, поворачиваемых на 360.
Для каждого образца, исследуемого по методу сенармоновской ДИК-микроскопии, существует оптимальная настройка (компенсатором Сенармона) сдвигового запаздывания, создающего максимальный уровень контрастности конечного изображения. Для очень тонких образцов с малым показателем преломления, например, живых клеток в культуре, оптимальными, как правило, являются малые значения сдвига (небольшие смещения поляризатора), ненамного превышающие максимальный фазовый сдвиг, существующий в образце (порядка одной двенадцатой длины волны, или 30 нм). Однако, чтобы получить удовлетворительные результаты для более толстых образцов, часто требуются более значительные задержки (до четверти длины волны) при больших апертурах конденсора и, как правило, путем получения оптического среза. Поскольку многие образцы состоят из компонентов различных размеров с разными показателями преломления, оптимальная настройка компенсатора Сенармона (значение сдвига), как правило, является компромиссом.
Получение оптических срезов в сенармоновской ДИК-микроскопии
Возможность сенармоновской ДИК-микроскопии создавать изображение образца при больших числовых апертурах конденсора и объектива позволяет получать необыкновенно тонкие оптические срезы в плоскости сфокусированного изображения. Свободный от мешающих гало и отвлекающих флуктуаций интенсивности (создаваемых яркими участками) в находящихся вне фокальной точки латеральных плоскостях, этот метод дает четкие изображения, являющиеся аккуратными срезами сложного трехмерного фазового образца. Это свойство часто используется для получения четких оптических срезов клеточных контуров сложных тканей, при минимальных помехах от структур, находящихся выше и ниже фокальной плоскости.
Во всех традиционных видах оптической микроскопии, выполняемой в проходящем и в отраженном свете, главную роль в определении контрастности и разрешения играет апертурная ирисовая диафрагма конденсора. Уменьшение размера апертуры повышает глубину поля и общую резкость изображения, одновременно улучшая его контраст. Однако, при слишком малых отверстиях диафрагмы становятся заметными дифракционные искажения, и ухудшается разрешение. Зачастую, оптимальная настройка апертурной диафрагмы представляет собой компромисс между возможностью точного отображения деталей образца с достаточной контрастностью и сохранением разрешения, необходимого для отображения мельчайших особенностей образца без дифракционных искажений.
Рис. 8. Получение оптических срезов в сенармоновской ДИК-микроскопии
Большинство высококачественных оптических ДИК-систем с компенсатором Сенармона создают превосходный контраст, когда значение ирисовой диафрагмы конденсора составляет, приблизительно, 70 процентов от размера задней апертуры объектива. Однако, микроскопы с такими оптическими системами превосходно работают и тогда, когда значение диафрагмы конденсора равно диаметру задней апертуры объектива. Для достижения оптимального баланса между разрешением и контрастом, в экспериментах по получению оптических срезов очень важно, чтобы конфигурация микроскопа соответствовала освещению по Келлеру, а компоненты призмы Номарского, анализатора и компенсатора Сенармона были точно отъюстированы.
На рисунке 8 представлены оптические срезы, полученные на колонии Volvox при исследованиях по методу дифференциально-интерференционного контраста с компенсатором Сенармона культуры тканей в инвертированном микроскопе. Водные микроорганизмы содержат от нескольких сотен до нескольких тысяч идентичных клеток зеленых водорослей, приблизительно, одного диаметра, но организованы в виде нескольких морфологических фрагментов. На периферии колонии отдельные клетки расположены в виде полупрозрачного, широкого слоя, называемого клейким (см. рисунок 8(a)). В глубине массива колония образует несколько концентрических сферических групп репродуктивных клеток, имеющих название гонидии, которые, в свою очередь, образуют небольшие дочерние колонии в пределах родительской колонии (рисунок 8(b)). При фокусировке микроскопа на самом верхнем слое клейких клеток колонии (рисунок 8©), становятся видны структурные детали отдельных клеток, однако многие клетки маскируются дочерней колонией.
Тонкие биологические образцы (толщиной 10 — 20 мкм) дают, как правило, плохие оптические срезы при низких уровнях увеличения, однако, при наблюдении через объективы с большим увеличением и большой числовой апертурой (60x и 100x), часто выявляют важные внутренние детали. Оптические срезы более толстых образцов легко получаются при малых увеличениях, создающих минимальные аберрации. Получению оптических срезов с более толстых биологических образцов, в особенности, погруженных в водный солевой раствор или в буферные растворы, зачастую мешает сферическая аберрация, обусловленная скачкообразным изменением показателя преломления на границе раздела между покровным стеклом и заливочной средой. По мере увеличения глубины проникновения, при получении серии оптических срезов, эта аберрация снижает разрешение.
Заключение
В микроскопии по методу дифференциально-интерференционного контраста разность фаз возникает за счет разности геометрических длин путей и различий в показателях преломления образца для двух ортогональных волновых фронтов, формируемых помещенной в конденсор призмой Номарского. В результате происходит эллиптическая поляризация волновых фронтов, которые воссоединяются призмой Номарского, и последующее формирование изображения прошедшими через анализатор составляющими волновых фронтов. Фазовый сдвиг в оптической системе можно получить путем перемещения призмы объектива вдоль оптической оси микроскопа, либо сочетанием четвертьволновой пластинки с поляризатором или анализатором (компенсатор Сенармона). Таким образом, оптимальный контраст, яркость поля и чувствительность могут быть достигнуты простым поворотом рукоятки регулировки. Использование в ДИК-микроскопии компенсатора Сенармона дает некоторые преимущества, в сравнении с традиционными конструкциями, основанными на перемещении призмы Номарского. Эти преимущества, отчасти, определяют растущую популярность метода Сенармона.
Для большинства ДИК-микроскопов, в которых используется перемещение призмы Номарского в задней фокальной плоскости объектива, трудно точно определить количественный фазовый сдвиг, создаваемый в оптической системе. В некоторых случаях используются призмы Номарского, установленные в оправы с прецизионными микрометрическими механизмами перемещения. Эти механизмы можно использовать для точного измерения сдвига, создаваемого перемещением призмы, с небольшим шагом. Однако, любой ДИК-микроскоп можно модернизировать для точного измерения сдвига при помощи компенсатора Сенармона. Для этого достаточно добавить в оптическую систему микроскопа поворотный поляризатор или анализатор с измерительной шкалой и неподвижную четвертьволновую замедляющую пластинку.
Одна из конструкций микроскопов, наиболее удобная для количественного определения сдвига, представлена на рисунке 1. В основном корпусе такого микроскопа, между призмой Номарского в револьверодержателе объективов и окулярными тубусами, установлен промежуточный тубус. В промежуточном тубусе установлен стандартный (на длину волны 550 нанометров) компенсатор Сенармона (изначально предназначенный для измерений в поляризованном свете). Компенсатор смонтирован в неподвижной оправе так, что его «быстрая» ось расположена параллельно поляризатору (восток-запад), а «медленная» — параллельно анализатору (север-юг). Над компенсатором Сенармона находится оправа с линейным поляризатором (работающим, как анализатор), поворачиваемая на 360 градусов, на которую нанесена шкала (в градусах). Рукоятка настройки кругового перемещения, часто оснащаемая микрометрическим нониусом, позволяет точно определять ориентацию оси распространения колебаний в линейном поляризаторе, и дает возможность контролировать (и измерять) значение сдвига с точностью до нескольких долей длины волны. Модифицировав ДИК-микроскоп, изначально предназначенный для создания сдвигового замедления путем перемещения призмы Номарского, до описанной выше конструкции, можно точно определять фазовый сдвиг. Однако, при этом важно сначала настроить согласованные призмы (для объектива и конденсора) на максимальное перекрытие интерференционных полос (максимальное ослабление), и только после этого устанавливать компенсатор Сенармона и поворотный анализатор.
Еще одно преимущество конструкции Сенармона состоит в близости компонентов компенсатора к важным сопряженным плоскостям формирования изображения и апертуры в оптической системе микроскопа. В микроскопах с подвижной призмой Номарского необходимо физически перемещать составную призму поперек оптического пути, а микроскопист в это время должен контролировать величину вносимого в систему сдвигового замедления. Во многих случаях, во время перемещения призмы, в особенности при неплотной посадке ее оправы, возможны серьезные смещения изображения. Такие смещения препятствуют наблюдению образца и проведению съемки. В процессе создания сдвигового замедления в ДИК-микроскопе с компенсатором Сенармона смещение изображения отсутствует, главным образом, потому, что фазовая пластинка компенсатора и поворотный поляризатор расположены перед конденсором или за объективом, т. е., в осветительном пути микроскопа, а не среди формирующих изображение оптических элементов. При выборе конструкции микроскопа для проведения количественных экспериментов по методу дифференциально-интерференционного контраста, это отличие следует рассматривать, как главный фактор.
При сравнении микроскопов традиционной и сенармоновской конструкций важно учитывать, также, и эргономические аспекты. Рукоятки фокусировки и управления предметным столиком современных микроскопов расположены в передней части основания микроскопа и легко доступны оператору. Эти особенности обеспечивают более свободную и комфортную позу оператора, при которой руки удобно опираются на стол, что снижает утомление и вероятность возникновения стресса, который, в конечном итоге, может привести к нейромышечным нарушениям. Работая с традиционным ДИК-микроскопом, оператор вынужден постоянно поднимать руку (и плечо) выше объектива, чтобы отрегулировать положение призмы Номарского. В эргономичной сенармоновской конструкции компенсатор установлен на основании микроскопа, над отверстием осветителя, рядом с низко расположенными рукоятками фокусировки и управления перемещением предметного столика. Непосредственная близость друг к другу всех механизмов управления ДИК-микроскопом такой конструкции кардинальным образом снижает утомление оператора во время длительного непрерывного наблюдения.
Современные методы видеомикроскопии обладают тем преимуществом, что дают возможность точно измерять значения сдвигового замедления, создаваемого компенсаторами Сенармона. Один из таких методов, часто обозначаемый сокращением VE-DIC (видео дифференциально-интерференционный контраст), позволяет регистрировать такие тонкие структурные детали образца, которые остаются вне пределов оптического разрешения составных микроскопов. Видео-модернизированная ДИК-микроскопия является мощным инструментом для проведения исследований в области клеточной биологии, где она позволяет измерять совокупную динамику отдельных микротрубок и визуализировать движение ресничек бактерий — с использованием иных методик то и другое, попросту, невозможно. Как уже упоминалось, большинство очень тонких ДИК-образцов лучше всего наблюдать при среднем значении сдвигового замедления в одну двадцатую длины волны. Однако, при использовании метода видео-дифференциально-интерференционного контраста для получения изображений образцов, требующих суб-разрешения (например, микротрубок или миниатюрных органелл), требуются волновые сдвиги, приблизительно, в одну сотую длины волны. Очевидно, что такие малые уровни замедления лучше всего достигаются при помощи компенсатора Сенармона, оснащенного прецизионным поворотным поляризатором (или анализатором) с нониусом и измерительной шкалой.
Говоря об основных преимуществах получения изображений с использованием микроскопии по методу дифференциально-интерференционного контраста, независимо от механизма создания волнового сдвига, следует отметить, что (в отличие от методов темнопольного или фазового контраста) мелкие детали образца не затемняются прилегающими к ним участками, имеющими более значительные градиенты оптических путей. Вдобавок, оттененное изображение на нейтральном сером фоне, в совокупности с чувствительностью в отношении как очень мелких, так и значительно более крупных деталей, (например, мельчайших придатков живых клеток или динамических включений и подвижных органелл в клетке), представляет собой существенное усовершенствование традиционных приемов улучшения контрастности. Упомянутые преимущества, в дополнение к широкому динамическому диапазону регулировки контрастности и малой глубине поля, способствуют росту популярности описываемого метода.
