В современных системах формирования изображений используются три основных варианта архитектуры матриц ПЗС: полнокадровая, с покадровым переносом и с построчным переносом (см. рисунок 7). Преимущество полнокадровой матрицы ПЗС, как уже упоминалось в описании процедуры считывания, заключается в практически 100-процентном использовании ее светочувствительной поверхности, на которой почти отсутствуют мертвые зоны между пикселями. На время считывания матрицы ПЗС ее рабочая поверхность должна быть защищена от света. Для этой цели, обычно, используется электромеханический затвор, управляющий экспозицией. После того, как затвор закроется, выполняется считывание и перенос заряда, накопленного за время экспозиции (время, в течение которого затвор остается открытым). Поскольку эти два процесса не могут происходить одновременно, скорость передачи кадров изображения ограничивается скоростью работы механического затвора, скоростью переноса заряда и количеством шагов в операции считывания. Хотя, полнокадровые устройства и обладают наибольшей из всех типов матриц ПЗС площадью светочувствительной поверхности, они более всего подходят для визуализации образцов с широким внутрикадровым динамическим диапазоном и для тех приложений, которые не требуют временнóго разрешения менее одной секунды. В режиме частичного использования матрицы (когда, с целью повышения скорости считывания, считывается только часть всего массива пикселей), максимально возможная скорость передачи информации составляет около 10 кадров в секунду, и ограничивается механическим затвором.
Для подробного ознакомления с медицинской и исследовательской техникой основных мировых производителей оптических систем и сопутствующего оборудования посетите наш каталог или свяжитесь с нашими специалистами и получите полную профессиональную консультацию по любым, имеющимся у Вас, вопросам.
Камеры с покадровой передачей могут передавать информацию об изображении быстрее, чем полнокадровые устройства, поскольку при покадровой передаче экспозиция и считывание могут выполняться одновременно, с различной степенью временнóго перекрытия. По конструкции параллельного регистра они аналогичны полнокадровым устройствам, но одна половина прямоугольной матрицы пикселей закрывается непрозрачной маской и используется в качестве буфера хранения для фотоэлектронов, генерируемых открытой частью светочувствительной матрицы. По окончании экспонирования изображения, накопленный светочувствительными пикселями заряд быстро (обычно, за 1 миллисекунду) сдвигается в пиксели буферной части матрицы. Поскольку пиксели хранения защищены от воздействия света алюминиевым, или аналогичным непрозрачным покрытием, хранящийся в этой части матрицы заряд можно систематически считывать с более медленной скоростью, обеспечивающей меньшие потери заряда, а на светочувствительную часть матрицы в это время может экспонироваться очередное изображение. При этом становится ненужным затвор, поскольку время, необходимое для переноса изображения из области формирования в область хранения, составляет только часть времени типовой экспозиции (выдержки). Благодаря отсутствию в них механического затвора, камеры с матрицами покадрового переноса могут работать в непрерывном высокоскоростном режиме передачи кадров, и с успехом использоваться для исследований быстрых кинетических процессов, например, по методу, визуализации относительного содержания красителей, где важны пространственное разрешение и динамический диапазон. Недостаток фотоприемников такого типа заключается в использовании для формирования изображений только половины матрицы ПЗС. Вследствие этого кристалл имеет бóльшие, чем у полнокадрового устройства с эквивалентным фотоприемником, размеры, что удорожает камеру и накладывает ограничения на ее физическую конструкцию.
В матрице ПЗС с построчным переносом заряда, столбцы активных пикселей изображения и закрытые масками столбцы пикселей хранения-переноса чередуются по всему массиву параллельного регистра. Поскольку канал переноса непосредственно примыкает к каждому столбцу светочувствительных пикселей, для того, чтобы накопленный заряд попал в канал переноса его (заряд) необходимо сдвинуть всего на один столбец. Этот единственный шаг переноса можно выполнить менее чем за 1 миллисекунду, после чего матрица хранения считывается при помощи параллельных сдвигов в последовательный регистр, а массив светочувствительных пикселей в это время экспонируется очередным изображением. Благодаря электронному управлению интервалами экспонирования, архитектура с построчным переносом позволяет использовать очень малые времена интегрирования, а вместо использования механического затвора для защиты матрицы от света, ее можно эффективно сделать нечувствительной к свету путем сброса накопленного заряда, вместо сдвига его в каналы переноса. Хотя фотоприемники построчного переноса позволяют выполнять высококачественное считывание изображений ярко освещенных объектов на скоростях видеорежима, базовые модели ранних устройств страдали от узкого динамического диапазона, низкого разрешения и чувствительности, вследствие того, что около 75% поверхности матрицы ПЗС были заняты каналами хранения-переноса.
Несмотря на то, что ранние модели матриц ПЗС с построчным переносом, например, использующиеся в камкордерах, обеспечивают высокую скорость считывания и передачи кадров и не требуют применения затворов, они не обладают должными параметрами для использования в микроскопии высокого разрешения при низких уровнях освещенности. Помимо пониженной светочувствительности, свойственной конструкции с чередованием столбцов формирования изображения и столбцов хранения-переноса, высокие скорости считывания создавали сильные помехи и сужали динамический диапазон ранних моделей ПЗС-камер. Благодаря совершенствованию конструкций фотоприемников и электронных компонентов камер ситуация изменилась до такой степени, что современные построчные матрицы ПЗС обеспечивают цифровым камерам превосходные параметры, позволяющие использовать такие камеры в микроскопии, включая исследования с низкими уровнями освещенности, например, регистрацию малых концентраций флуоресцентных молекул. Прикрепленная микрооптика, отъюстированная на поверхности матрицы ПЗС, так чтобы охватить пары пикселей формирования-хранения сигнала, собирает световые потоки, которые, без этих линз, попали бы на закрытые пиксели и были бы потеряны, и фокусирует их на светочувствительные пиксели (см. рисунок 8). Благодаря сочетанию пикселей малых размеров и микролинз, фотоприемники с построчным переносом способны обеспечивать пространственное разрешение и эффективность использования светового потока, сравнимые с полнокадровыми и покадрового переноса матрицами ПЗС. Эффективная светочувствительная поверхность фотоприемников построчного переноса со встроенными микролинзами составляет 75–90% от площади поверхности.
Кроме того, встраивание микролинз в структуру матриц ПЗС позволяет расширить спектральную чувствительность фотоприемника в синюю и ультрафиолетовую области спектра. Это предоставляет дополнительные возможности в сфере коротковолновых приложений, например, в области популярных методик с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) и красителей, возбуждаемых ультрафиолетовым излучением. С целью повышения квантового выхода в видимой части спектра, в новейшие высококачественные кристаллы встраиваются затворные структуры из материалов, обладающих высокой прозрачностью в сине-зеленом диапазоне спектра, например, из оксида индия и олова. Такие непоглощающие затворы позволяют приблизить квантовый выход в зеленой части спектра к 80%.
Рис. 6. Схема синхронизации трехфазной матрицы ПЗС
Прежние ограничения, связанные с узким динамическим диапазоном матриц ПЗС с построчным переносом, преодолены, главным образом, благодаря совершенствованию электронных компонентов, что позволило снизить шум чтения в камере почти в два раза. Поскольку активная площадь пикселей матрицы ПЗС с построчным переносом, примерно, в три раза меньше, чем у полнокадровых устройств, полная емкость потенциальной ямы (функция площади пикселя), аналогичным образом, меньше. В прошлом, этот фактор, вкупе со сравнительно высокими шумами камеры, был причиной узкого динамического диапазона, не позволявшего получать в результате аналогово-цифрового преобразования разрешение более 8–10 разрядов. Шумы считывания современных высококачественных камер с построчным переносом составляют не более 4–6 электронов, обеспечивая динамический диапазон, эквивалентный динамическому диапазону 12-разрядных камер с полнокадровыми матрицами ПЗС. Дополнительные усовершенствования схем синхронизации и электронных узлов камеры позволили повысить скорости считывания. Современные камеры построчного переноса позволяют получать 12-разрядные мегапиксельные изображения на частоте 20 МГц, что почти в четыре раза превышает аналогичный параметр полнокадровых камер с матрицами ПЗС сравнимых размеров. В некоторые конструкции матриц ПЗС построчного переноса вносятся и другие усовершенствования, включая изменение состава полупроводника, с целью повышения квантового выхода в ближней инфракрасной области спектра.
Функциональные характеристики фотоприемников на приборах с зарядовой связью
Некоторые рабочие параметры камеры, определяющие этап считывания в процессе формирования изображения, влияют на качество последнего. Скорость считывания в большинстве ПЗС-камер научно-исследовательского класса регулируется, и находится, обычно, в диапазоне от 0,1 МГц до 10 — 20 МГц. Максимально возможная скорость зависит от скорости работы АЦП и других электронных компонентов камеры, определяющих время, необходимое для аналогово-цифрового преобразования одного пикселя. Для изучения быстрых кинетических процессов необходимы высокие скорости считывания и передачи кадров, позволяющие достичь требуемого временнóго разрешения. В некоторых ситуациях необходимо передавать видеоданные со скоростью 30 и более кадров в секунду. К сожалению, среди различных шумовых составляющих, которые всегда присутствуют в электронном изображении, основной компонентой является шум чтения, и с повышением скорости считывания уровень этой компоненты возрастает. Когда максимальное временнóе разрешение не требуется, улучшить изображение образца, создающего пиксели низкой интенсивности, можно за счет снижения скорости считывания до значения, обеспечивающего минимальный уровень помех при адекватном отношении сигнал/шум. В тех случаях, когда для исследования динамических процессов требуются высокие скорости формирования и передачи кадров изображения, можно изменить стандартную последовательность считывания, снизив количество обрабатываемых зарядовых пакетов, что, в некоторых случаях, позволяет повысить скорость формирования изображения до нескольких сотен кадров в секунду. Такого повышения скорости формирования и передачи кадров можно достичь за счет объединения пикселей во время считывания матрицы ПЗС и /или за счет считывания только части этой матрицы (см. ниже).
Программное обеспечение большинства использующихся в оптической микроскопии ПЗС-камер позволяет выделить из всей матрицы некоторое подмножество пикселей, или субматрицу, для получения и отображения изображений. При выделении (для обработки) только части поля изображения, не вошедшие в это поле пиксели не обрабатываются аналого-цифровым преобразователем, в результате чего скорость считывания повышается. В зависимости от используемой управляющей программы камеры, размер субматрицы можно выбрать из ряда стандартных значений, либо определить интерактивно, в виде области интереса, воспользовавшись компьютерной мышью и дисплеем. Метод выделения субматрицы считывания используется, обычно, для получения последовательностей изображений в заданный интервал времени, с тем, чтобы уменьшить размеры файлов изображений и упростить работу с ними.
В процессе считывания, накопленные зарядовые пакеты смежных пикселей матрицы ПЗС можно объединять и создавать меньшее количество суперпикселей. Этот процесс носит название бининг, и осуществляется в параллельном регистре, путем параллельного сдвига в последовательный регистр двух или более рядов, прежде чем выполнить процедуру последовательного сдвига и считывания. Процесс бининга, как правило, повторяется и в последовательном регистре, путем нескольких сдвигов зарядовых пакетов в модуль считывания, прежде чем результирующий заряд будет подан на вход выходного усилителя. Организовать можно любую комбинацию параллельных и последовательных сдвигов, однако, обычно, в каждый отдельный суперпиксель объединяют симметричную матрицу пикселей (см. рисунок 9). Например, для реализации бининга 3×3 сначала выполняются 3 операции параллельного сдвига (соответственно, трех рядов) в последовательный регистр. С этого момента каждый из пикселей последовательного регистра содержит объединенный заряд 3-х пикселей, которые соседствовали в смежных параллельных рядах. Затем, до измерения заряда, выполняются 3 такта последовательного сдвига в выходной модуль. Результирующий зарядовый пакет обрабатывается, как один пиксель, однако содержит фотоэлектроны 9-и физических пикселей (или суперпикселя формата 3×3). Хотя бининг и ухудшает пространственное разрешение, этот метод, зачастую, позволяет получать изображения в таких условиях, когда с использованием стандартной схемы считывания сделать это просто невозможно. Кроме того, бининг позволяет повышать скорость передачи кадров последовательностей изображений, когда эта скорость ограничивается циклом чтения, который задает камера. Помимо этого, при равных временах выдержки бининг обеспечивает лучшее отношение сигнал/шум. Среди дополнительных преимуществ, следует отметить более короткое время экспонирования, требующееся для получения изображений определенной яркости (чрезвычайно важное качество для съемки живых клеток), а также меньшие размеры файлов изображений, что снижает требования к объему ресурсов хранения компьютера и ускоряет обработку изображений.
Третьим фактором формирования изображений в камере, который может влиять на качество изображения, поскольку изменяет процесс считывания информации с матрицы ПЗС, является коэффициент передачи (усиления) электронной системы камеры. Настройка коэффициента передачи цифровой ПЗС-камеры устанавливает, какое количество накопленных фотоэлектронов определяет каждую из ступеней уровня яркости, которую способна различить система считывания, и применяется, как правило, на этапе аналого-цифрового преобразования. Увеличение коэффициента усиления соответствует уменьшению количества фотоэлектронов, приходящихся на одну градацию яркости (количество электронов/ADU), и позволяет разделить данный сигнал на большее количество уровней яркости. Отметим, что этот метод отличается от выбора коэффициента усиления в фотоумножителях и в видиконах, где изменяющийся сигнал усиливается с определенным коэффициентом. Хотя регулировка усиления и предоставляет метод увеличения ограниченной амплитуды сигнала до требуемого количества уровней яркости, слишком малое количество электронов, которым будут отличаться смежные уровни яркости в результате чрезмерного повышения этого коэффициента, может приводить к ошибкам аналого-цифрового преобразования. Высокий коэффициент усиления может стать причиной возникновения шумов из-за ошибок аналого-цифрового преобразования, которые будут проявляться в виде зернистости конечного изображения. В том случае, когда требуется сократить время экспонирования, повышение коэффициента передачи позволяет сохранить неизменным количество уровней яркости, несмотря на снижение уровня сигнала, при условии, что такое повышение не приведет к чрезмерному ухудшению качества изображения. В качестве примера влияния применения различных коэффициентов усиления к сигналу постоянного уровня, рассмотрим вариант, когда исходное значение коэффициента усиления, при котором каждой единице ADU (уровню яркости) соответствуют 8 электронов, определяет, что сигнал пикселя, содержащего 8000 электронов, будет отображаться с использованием 1000 уровней яркости. В результате увеличения исходного коэффициента усиления в 4 раза, количество электронов, соответствующих одному уровню яркости, уменьшится до 2 (2 электрона/ADU), и система аналого-цифрового преобразования будет различать 4000 уровней яркости.
Рис. 7. Типовые архитектуры приборов с зарядовой связью (ПЗС)
Качество цифрового изображения можно оценить по четырем количественно-измеримым критериям, которые определяются, частично конструкцией матрицы ПЗС, а также отражают реализацию уже упоминавшихся рабочих параметров камеры, непосредственно влияющих на рабочие характеристики ПЗС-фотоприемника. Ниже перечислены основные критерии качества изображения и характер их проявления.
- Пространственное разрешение. Определяет способность визуализировать мельчайшие детали образца, без проявления пикселей на изображении.
- Разрешение по интенсивности освещения. Определяет динамический диапазон или количество уровней яркости (градаций серого цвета), различимых на отображаемом изображении.
- Временнóе разрешение. Частота дискретизации (скорость передачи кадров) определяет способность отслеживать перемещение живого образца или быстрые кинетические процессы.
- Отношение сигнала к шуму. Определяет различимость и чистоту сигналов от образца, относительно фона изображения.
При формировании изображений в микроскопии, как правило, невозможно одновременно оптимизировать все важные критерии обеспечения качества одного изображения, или последовательности изображений. Получение изображений наилучшего качества, в рамках ограничений, накладываемых конкретным образцом или экспериментом, требует, как правило, отыскания компромисса между перечисленными критериями, которые, зачастую, выдвигают противоречивые требования. Например, получение в заданный интервал времени последовательности изображений живых флуоресцентно-помеченных образцов, может потребовать сокращения общего времени экспонирования, чтобы минимизировать фотообесцвечивание и фототоксичность. Решить такую задачу можно несколькими способами, хотя, каждый из них влечет ухудшение того или иного параметра получения изображения. Менее частое экспонирование образца ухудшает временнóе разрешение; использование бининга для сокращения интервалов экспонирования снижает пространственное разрешение; увеличение коэффициента передачи сужает динамический диапазон и ухудшает отношение сигнал/шум. Для получения оптимальных результатов в различных ситуациях часто требуются совершенно разные подходы к получению изображений. В отличие от предыдущего примера, чтобы достичь максимального динамического диапазона для единственного изображения образца, требующего короткой экспозиции, использование бининга, или повышение коэффициента передачи, может решить поставленную задачу, не оказывая значительного отрицательного влияния на качество изображения. Для квалифицированного выполнения цифровой визуализации требуется доскональное знание решающих критериев качества изображения, а также практических аспектов сбалансированной настройки рабочих параметров камеры, с целью максимального удовлетворения наиболее важных для конкретной ситуации требований.
